Imagerie in vivo des réponses des neurones ganglionnaires géniculés à l’aide de la microscopie épifluorescente

Résumé

Source : Fowler, B. E., et al. Imagerie calcique in vivo des réponses des neurones ganglionnaires géniculés de souris aux stimuli gustatifs. J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo montre un protocole permettant d’administrer des arômes au ganglion géniculé exposé chirurgicalement chez une souris anesthésiée et d’utiliser la fluorescence GCaMP avec la microscopie épifluorescente pour visualiser les réponses neuronales en temps réel, ce qui facilite les études sur le traitement du signal gustatif périphérique.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Exécutez tastant panel
   1. Utilisez l’aspiration pour éliminer le liquide sur le géniculé. Placez éventuellement un point absorbant pour aider à atténuer les infiltrations et faciliter la navigation au microscope.
   2. Placez l’animal sur un tampon absorbant sous le microscope. Localisez le ganglion géniculé : les points de repère utiles comprennent le trou laissé dans la bulle, le trou dans l’os temporal et le septième nerf. À l’aide du filtre FITC/GFP (Fluorescein Isothiocyanate/green fluorescent protein) sur l’endoscope d’épifluorescence, vérifiez la présence de neurones ganglionnaires géniculés exprimant GCaMP. Un objectif 10x (distance de travail de 10 mm) fournira une résolution suffisante pour suivre l’activité de cellules individuelles, mais un objectif 20x (distance de travail de 12 mm) peut également être utilisé.
   3. Placez fermement l’aiguille de distribution de la ligne de dégustation dans la bouche de l’animal. Placez une boîte de Pétri sous la bouche de l’animal pour récupérer le liquide.
   4. Assurez-vous que la caméra visualise le champ de vision du microscope. Synchronisez le début de l’enregistrement vidéo avec le début de la présentation gustative.
   5. Pendant l’enregistrement, regardez le flux en direct pour les réponses, la dérive et l’infiltration.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1ml Seringue avec luer lock	Fisher Scientific	14-823-30
Aiguille de distribution émoussée de calibre 27	Fisher Scientific	NC1372532
points absorbants	Fisher Scientific	50-930-668
Acesulfame K	Fisher Scientific	A149025G
BD Plateaux d’allergologue avec aiguille fixée en permanence	Fisher Scientific	14-829-6D
Écarteurs émoussés	FST	18200-09
Breadboard	Thor Labs	MB8
Custom Head Post Holder	eMachineShop		Voir le fichier joint 202410.ems
Poteau de tête en métal personnalisé	eMachineShop		Voir le fichier joint 202406.ems
Contrôleur de température DC	FHC	40-90-8D
Appareil photo numérique, sCMOS OrcaFlash4 Microscope monté	Hamamatsu	C13440
Lunette de disection	Leica	M80
LED Source de lumière froide	Leica Mcrosystems	KL300LED
Luer Lock 1/16" Adaptateurs de tubes	Fisher	01-000-116
Microscope	Olympus	BX51WI
Mini-series Poteaux	optiques Thorlabs	MS2R
Boîtes de Pétri	Fisher Scientific	FB0875713A
Air pressurisé	Airgas	AI Z300
Étiquetage auto-adhésif Ruban	Fisher Scientific	159015R
Tube de soupape à manchon en silicone 1/32 » x 1/16 » de diamètre extérieur (par pied)	Automate Scientific	05-14
Snap25-2A-GCaMP6s-D	JAX	25111
Ciseaux fins pour étudiants	Outils scientifiques fins	91460-11
Sonde chirurgicale	Roboz Surgical Store	RS-6067
Support de sonde chirurgicale	Roboz Surgical Store	RS-6061
BD Intramedic Tubing	Fisher Scientific	22-046941
Régulateur de gaz à deux étages	Airgas	Y12FM244B580-AG
Tube en vinyle Tygon - 1/16"	Automate Scientific	05-11
Valvelink8.2 contrôleur numérique/manuel	Automate Scientific	01-18
Valvelink8.2 Système de perfusion de valve à manchon	Automate Scientific	17-pp-54
Xylazine	Anased	NADA# 139-236